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科研级AAV常见问题解答

Q: 什么是AAV?
腺相关病毒(AAV)是一种单链DNA病毒,目前的科学界共识是它不会导致任何人类疾病。它由蛋白衣壳(capside)和长度为4.7kb的单链DNA基因组构成。蛋白衣壳由三个亚基组成,分别为VP1,VP2,和VP3。AAV基因组两端为两个“T”型的末端反向重复序列(inverted terminal repeat, ITR)。这两个ITRs是病毒DNA复制的起点和触发病毒包装的信号。

作为基因疗法载体的重组腺相关病毒(rAAV)携带的蛋白衣壳与野生型AAV几乎完全相同,然而衣壳内的基因组中编码病毒蛋白的部分完全被删除,取而代之的是治疗性转基因(transgene)。AAV基因组中唯一被保留的部分是ITRs,它起到指导基因组的复制和病毒载体组装的作用。将编码病毒蛋白的部分完全删除的优点是:一方面可以最大化重组AAV携带转基因的容量,另一方面减小体内递送转基因时产生的免疫原性和细胞毒性。

rAAV在感染细胞后会头尾相连形成环状,能长期存在而不被细胞系统当作外源DNA降解,因此可以在哺乳动物器官或组织中长期保留,并且只有极低的整合基因组机率。这个特性使AAV成为基因治疗的首选载体,也同样成为科学研究中在动物体内传递外源基因的一个优异载体。

AAV作为新一代基因治疗载体,还有一个很重要的特性在于其特异性强。得益于AAV的不同血清型,每种血清型对不同的脏器有较高的识别及感染能力,配合以合适的注射方法,会取得更好的效果。如果您做动物实验,建议首选AAV。

Q: rAAV作为基因传递载体,包装外源序列的上限是多少?

rAAV的基因组包装上限约为5Kb,除去两端ITR序列各145bp,则能容纳4.5Kb的外源序列;即:启动子+外源基因+终止信号的总长度不能超过4.5kb;派真的K104载体提供了目前最小的广谱启动子miniCMV(CMV的核心区域,180 bp)及终止子(50 bp)表达盒,可表达约4.4Kb长度的基因,已是能包装基因长度的极限。

Q: scAAV和ssAAV的区别

双链AAV(scAAV)感染后2~3天表达水平可到达峰值,单链AAV(ssAAV)感染后表达到达峰值的时间需要约7天;因为单链AAV进入细胞后必须变成双链DNA才能转录和翻译外源基因,这个过程非常缓慢;双链AAV(scAAV)感染效率比单链AAV(ssAAV)有6-15倍的提高;相同的滴度,双链AAV(scAAV)的生产规模需要比单链AAV(ssAAV)的生产规模大,所以双链AAV的包装价格更贵一些。

Q: rAAV滴度单位GC/ml代表什么?如何检测?

GC代表genomic copies,基因拷贝数;GC/ml表示每ml病毒液的病毒颗粒中含有的基因组拷贝总数;派真生物采用SYBRgreen 荧光定量PCR检测AAV的滴度,同时用ATCC标准品校正;特异性PCR引物是针对ITR区;派真生物提供的滴度是1E+13GC/ml以上; V.G./ml:Vector Genomes/ml的缩写,也是表示AAV病毒载体的滴度,等同于GC/ml。也是指每ml病毒液中含有的基因组拷贝数。通常用点杂交(dot-blotting)方法、QC-PCR方法、real time-PCR方法来测定。通常在测定前对样品用DNaseI处理,因此该滴度表示方法一般指每ml病毒液的病毒颗粒中含有的基因组拷贝总数。

Q: rAAV有哪些血清型?如何选择合适的血清型?

现阶段已经发现的AAV有10多种血清型(AAV1/2/3/4/5/6/7/8/9/PHP.eB/PHP.B/PHP.S/rh10/DJ/2-retro)以及多种突变型。由于cap衣壳蛋白的氨基酸序列和空间结构的不同,识别与结合的细胞表面受体也有很大的差异,所以导致不同血清型AAV感染的细胞和组织类型和感染效率也各不相同。

文献中对各组织的AAV血清型感染能力可能存在不同结果,对于文献数据较少的靶组织,建议研究者用预实验测试确定最理想血清型,这也将是实验创新点之一。

细胞感染:AAVDJ(感染80%的细胞类型)和AAV6(感染血液来源的细胞)

Q: 客户定制服务项目(AAV载体构建)需要了解哪些信息?

① 客户是否有基因模板?如果有模板,需要测序验证之后提供给我们;

② 如果客户没有模板,需要合成基因?基因号、序列图谱、物种、基因长度;

③ 构建用什么启动子、需要添加什么标签或者荧光标记,是否要求几个基因共表达;

④ 注意AAV载体ITR之间的容量;

⑤ shRNA建议客户选择三个靶点,或者选择一个经过验证的靶点;我们帮忙设计的话,不保证感染效率,建议客户可以先用构建好的质粒在体外筛选一个最佳的感染靶点,再进行AAV病毒的包装。

Q: 客户定制服务项目(rAAV病毒包装服务)需要了解哪些信息?

① 根据感染的部位推荐不同的血清型;如果客户不确定血清型,可以参考相关文献;或者申请我们的不同血清型的荧光对照试用装进行筛选,再确定最佳的血清型;

② 如果客户自己提供质粒进行包装,需要客户提供载体图谱序列,确认载体是不是AAV载体,确认载体的ITR间距;跟客户确认质粒是否经过测序验证;

③ 确认客户的AAV病毒包装信息属于那一类型:A类、B类、C类、D类;

④ 确认需要包装的rAAV病毒的总量、滴度、分装要求。

Q: AAV纯化的方法及QC检测指标有哪些?

派真生物采用碘克沙醇 密度梯度离心的方法进行纯化;

派真生物的QC检测指标:

(1). 纯度:通过跑SDS-PAGE考马斯亮蓝染色观察纯度;

(2). 滴度:派真生物用ATCC标准品做校正,用SYBR Green QPCR检测滴度,最后滴度可以达到1E+13GC/ml以上;

(3). 内毒素检测:内毒素含量不超过10EU/ml;

(4). TEM电镜(可选项目):通过电镜观察空壳率(Empty/Full Ratio),低于30%以下;

(5). HPLC(可选项目):检测纯度;

(6). 质谱分析(可选项目):确定AAV血清型;

(7). ddPCR检测滴度(可选项目):没有标准品校正。