首页 > 支持中心 > GMP级AAV常见问题解答

GMP级AAV常见问题解答

Q: pH值测定是检测浓缩之前还是浓缩之后的pH?浓缩前后的pH是否会变化?如果是浓缩后,用pH计测定需要的样品量较多,是否会导致浪费?

A: pH值是rAAV成品放行必检项,如果希望节约样品,建议采用微量pH电极来实现,样品量一般仅需15uL-100uL。

Q: 装量怎么理解?

A: 按照药典通则0942,最低装量检查法进行标示装量的检测。如有变动,建议与CDE沟通。

Q: A260/A280反映的是DNA/蛋白的相对比值,它具体有什么意义?

A: A260/A280是DNA/蛋白的直观体现,对于rAAV而言,该指标可以侧面反映空壳率或者其他污染。当A260/A280过小,则空壳率可能偏高,当A260/A280过高,则其他污染可能过高。该方法的检测的优点是方便快捷,便于趋势跟踪。

Q: 一般来讲,蛋白杂质均来自宿主细胞和培养基,如果已经检测了宿主蛋白残留和BSA,再单独检测蛋白杂质又是基于什么考虑?

A: SDS-PAGE检测蛋白的目的是鉴别rAAV的衣壳蛋白条带,也能总体直观地反映蛋白杂质情况,除了宿主蛋白、BSA外,蛋白也可能是衣壳降解产物。

Q: 像rAAV这种非整合宿主基因组的病毒载体,如何检测感染滴度?

A: 目前检验的金标准是采用TCID50,基本原理是基于辅助病毒adenovirus H5细胞实验再采用qPCR检测。

Q: 检测基因的表达和功能,考虑到之前已经用相同的质粒包rAAV完成体外实验和小鼠实验,所以这两项算是做过了,只要DNA序列正确,基因表达和功能检测可以不做吗 ?

A: 基因表达跟工艺稳定性有关,也是属于效价(potency)的重要项。至于功能检测,建议与CDE沟通,从科学性角度做验证。

Q: rcAAV是否指双链互补AAV?我的AAV非自身互补,不知检测该指标是基于什么考虑?

A: rcAAV是指复制完整型AAV(replication competent AAV),是对具有复制能力的AAV做残留限定,也是法规要求的重点项目,从评审的角度涉及安全性的检验项目是重点关注的项目。

Q: 不溶性微粒,不知这项中的不溶性微粒与外观可见异物和可见异物项目有何区别?

A: 外观可见异物的检验方法是目测法,主要标准是无50μm以上异物,可见异物系指存在于注射剂、眼用液体制剂和无菌原料药中,在规定条件下目视可以观测到的不溶性物质,其粒径或长度通常大于50μm,此项目针对所有液体制剂【参引药典通则0904】。

不溶性微粒的检验方法通常采用不溶性微粒仪,关注的微粒范围为含10μm及以上的微粒。针对检查静脉用注射剂(溶液型注射液、注射用无菌粉末、注射用浓溶液)及供静脉注射用无菌原料药中不溶性微粒的大小及数量,可根据自己项目性质进行评估。【参引药典通则 0903】

Q: 对于支原体和细菌内毒素,是基于安评的考虑,之前已经做了两批小鼠实验,结果都没问题,这两项是否可以不做?

A: 基因治疗国内法规参见CDE颁布《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》需进行该支原体、内毒素的检验。如有疑问,建议与中检院、CDE做沟通。

Q: 派真细胞库的来源?

A: 派真293细胞库的来源是获得正式商用授权的。

Q: 派真生物单次发酵的生产体积?对应的AAV产量是多少?

A: 单次贴壁发酵体积:2L, 7L, 25L, 50L, 200L,均为单个反应器。产量不同AAV血清型可能不同,以AAV9(以中高产血清型为例): 2L的产量在1E+14GC,50L为1E+16GC,100L为2E+16GC

Q: genome copy/mL(GC/mL)与 vg/mL(virus genome/mL)的单位是否具有换算关系?派真测定腺相关病毒GC/mL是采用何种方法?如果是q-PCR,是采用病毒自身特异引物,还是采用插入表达序列特异性引物?

A: enome copy/mL=gc/ml= vg/mL(virus genome/mL)。测定GC采用q-PCR和ddPCR两种方式。qPCR涉及标曲标准品的标定;ddPCR可以设置参比品质控,非必需项。ddPCR在精密度的验证上%RSD更低,特别是中间精密度。qPCR更容易存在实验室间与操作人员间的偏差。工艺摸索和中间品主要采用qPCR,终产品的滴度通常用ddPCR。GC方法开发可采用GOI靶基因的特异性引物,前期开发阶段也可采用polyA或者ITR等元件作为通用型检测。

GMP产品建议用特异性引物,终产品滴度检验均基于特异性引物检验放行的。

Q: 对于包装生产的腺相关病毒成品,有否对空壳率进行测定,用什么方法,空壳率维持在一个什么样的水平?

A: 通常采用AUC、TEM、CyroTEM、或者VG TITER/CAPSID TITER,但是AUC、TEM、CyroTEM不适合作为QC放行用,用于质量研究和工艺开发用会更好。目前采用阴离子色谱HPLC进行方法开发,派真可以提供分析方法开发服务并与CyroTEM、AUC检验结果进行比对验证。

空壳率每个血清型用柱层析得到的空壳率都有不同。派真生物生产的AAV9在10%以内。

Q: 细胞库的检定是否按照中国药典2015三部通则《生物制品生产检定用动物细胞基质制备及检定规程》进行?

A: 是的

Q: 通用检项中未见HIV,HBV,HCV检测,无热原质试验,野毒检测,这些是否需要检测,但是不属于通用检项?

A: 产品收获液会根据工艺特性进行外源病毒因子检测,不列入原液和成品标准中。

Q: 目前分析方法可接受的误差或偏差范围?

A: 一般生化类方法的%RSD通常为15%-25%,ddPCR接受标准为10%,但通常验证数据为<5%,TCID50的%RSD为小于100%。

Q: 对于批次送检的样本,有什么送样量的要求吗?

A: 建议单次委托快递送样量不低于50uL体积,避免冻融、蒸发、管壁的影响。基因组滴度、质粒DNA残留、rcAAV等建议送样量10ul以上,感染滴度送样量建议20 ul以上,检测空壳率的送样量建议达到5×1013vg。